jenabioscience:Atto 425蛋白質標記試劑盒

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學家于1998年成立，利用超過25年的學術知識為100多個國家的研究和行業(yè)客戶開發(fā)創(chuàng)新試劑。

供一般實驗室使用。

運輸:凝膠包裝運輸

儲存條件:儲存在-20°C
避光儲存，參見手冊

保質期:12個月

光譜特性:
激發(fā)最大值:λexc= 436納米發(fā)射最大值:λ全身長的= 484納米消光系數(shù):ε最大= 45000摩爾-1厘米-1校正系數(shù):CF280納米 = 0.23

描述:
熒光技術已經成為生物科學的主要工具。熒光蛋白如GFP和DsRed融合到感興趣的蛋白(POI)允許表達分析和體內蛋白定位。然而，由于這些融合蛋白的大分子量，它們的應用受到限制。此外，相關的分子生物學是乏味和耗時的。
共價連接到POI上的小熒光團可能有助于克服這個問題。半胱氨酸巰基的熒光標記對于研究POI的結構、功能和相互作用是優(yōu)選的。(請注意:Jena Bioscience提供了一個即用型試劑盒，用于用高質量的小熒光團標記半胱氨酸殘基(Cat。# FP-202)用于蛋白質活性和功能研究)。
然而，最常見的蛋白質標記方法是胺修飾。胺反應性熒光團如NHS-酯容易與N-末端[1]以及賴氨酸側鏈上的伯氨基反應，形成穩(wěn)定的共價鍵。
這種Jena Bioscience蛋白質標記試劑盒設計用于用小熒光團標記POI的賴氨酸，產生熒光蛋白質-熒光團綴合物。它包含對1mg POI進行10次單獨標記反應所需的所有試劑。

內容:
atto 425 NHS-酯
1瓶含1毫克

二甲基甲酰胺
200微升

碳酸氫鈉
1瓶含84毫克

超純水
1毫升

儲存和穩(wěn)定性:
收到后，將染料儲存在-20°c下。其他成分可儲存在室溫下。如果按照建議儲存，Jena Bioscience保證該產品在12個月內保持最佳性能。

協(xié)議:
一般注意事項
最佳蛋白質濃度為10 mg/ml，其他濃度也是可能的，然而，它應該至少為2 mg/ml，因為標記效率受到較低蛋白質濃度的影響。我們建議每個標記反應使用大約1毫克蛋白質。
含有伯胺如Tris和甘氨酸的緩沖液不適用于標記反應，必須在開始標記反應前用合適的不含胺的緩沖液如PBS、MES或HEPES替換。

實驗協(xié)議

• 加入1毫升超純水溶解碳酸氫鈉。得到的1 M溶液在4°C下至少穩(wěn)定2周。
• 向蛋白質溶液中加入適量的碳酸氫鈉(1 M ),使最終濃度達到100 mM
• 通過添加100 μl DMF制備染料，使染料濃度達到10 mg/ml。渦旋直至NHS酯*全溶解！我們建議在使用前立即制備溶液，然而，它在-20°c下可穩(wěn)定保存兩周。無論何時處理熒光團或共軛物，請在弱光條件下工作！
• 將100微升蛋白質溶液(10毫克/毫升)和10微升染料(10毫克/毫升)加入適當?shù)男∑恐小Ｐ⌒臏u旋并短暫離心，收集試管底部的反應混合物。
• 室溫下在搖床中培養(yǎng)一小時。避光！
• 使用標準凝膠過濾柱如Sephadex G-25或類似物純化綴合物。或者，可以通過透析或合適的自旋濃縮器將游離染料從綴合物中分離出來。

請注意，該套件不提供蛋白質純化材料！

共軛物的濃度
因為在標記過程中，特別是在純化過程中，可能會發(fā)生一定的蛋白質損失，所以測量綴合物的濃度對于進一步的應用是重要的。蛋白質的濃度通常通過測量其在280 nm處的吸光度來確定。然而，如Atto 425的激發(fā)光譜所示，熒光染料也在280 nm處吸收，從而增加了λ280對于共軛。因此，需要一個校正系數(shù)(CF)來消除280 nm處染料的影響。
每種染料的CF在光譜數(shù)據部分給出，因此綴合物的濃度根據下式計算:

c(毫克/毫升)= ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白質

標記度
DOL表示每分子綴合物中熒光團分子的平均數(shù)。它是共軛物的一個重要參數(shù)，顯著地影響進一步的應用。對于大多數(shù)目的，每200個氨基酸大約1個熒光團分子的DOL是理想的，也參見故障排除部分。
DOL的計算公式如下:

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) x ε最大)

測定用Atto 488 NHS酯標記的BSA(牛血清白蛋白)的結合物濃度和DOL的實例:
牛血清白蛋白:ε280= 42925米-1厘米-1，MW = 66，433 Da
Atto 488: λexc= 501納米，ε最大= 90，000米-1厘米-1，CF = 0.1

標記和純化后，分別在280和501 nm測量結合物溶液的吸收。

計算綴合物濃度和DOL:

c(毫克/毫升)= ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白質
c(毫克/毫升)=((1.69-7.23 x 0.1)/42925)x 66433
c(毫克/毫升)= 1.5

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) x ε最大)
DOL =(7.23 x 42925)/((1.69-7.23 x 0.1)x 90000)
DOL = 3.57

在該實驗中，綴合物的濃度為1.5 mg/ml，大多數(shù)蛋白質分子用三個或四個Atto 488分子標記，相當于每200個氨基酸有1.2個Atto 488分子。
請注意，結合物的濃度和DOL的光譜測定不是絕對正確的。游離染料的光譜特征與結合到POI的染料的光譜特征不全相同。此外，天然蛋白質在280 nm處的光譜特征不同于綴合物的光譜特征。
一般來說，這些變化小得可以忽略不計，因此，光譜測定結合物的濃度和DOL是*常用的方法[3]。
除了光譜測量之外，可以通過SDS-PAGE和隨后的凝膠熒光掃描來分析綴合物。在熒光掃描中應該只有一條帶(由熒光標記的蛋白質組成)可見。如果在非常低的分子量下有一個額外的帶，結合物溶液仍然含有游離染料，必須再次純化。

結合物的儲存
避光！像未標記的蛋白質一樣儲存結合物。我們建議將溶液分成小份，并在-20°C或-80°C下冷凍。避免反復冷凍和解凍！

故障排除:
低效標記

• 蛋白質溶液的濃度

  
  

  該分析被優(yōu)化用于標記濃度為10 mg/ml的1 mg蛋白質。

  
  

  蛋白質濃度高于10毫克/毫升時，按比例增加染料量。如果您的蛋白質濃度非常低(< 1毫克/毫升)，請使用旋轉濃縮器以達到2毫克/毫升的最終濃度。

  
  

  標記的效率強烈依賴于濃度，并且在不同的蛋白質之間有所不同。因此，在每一種情況下，優(yōu)化可能是必要的，以獲得所需程度的標記。
• 緩沖成分

  
  

  含有伯胺(甚至微量)的蛋白質溶液會顯著降低標記效率。確保你的蛋白質被充分透析，以防它與含胺物質接觸。
• pH值的影響

  
  

  檢查你的蛋白質溶液的pH值！參考范圍是8.2 - 8.5。

  
  

  蛋白質的伯氨基不能被質子化而具有活性，因此，蛋白質溶液的pH值必須足夠高。另一方面，NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加，導致非活性染料。最佳標記結果在pH 8.3獲得。

  
  

  在pH值較低的強緩沖蛋白質溶液中，100 mM碳酸氫鈉可能不足以將pH值提高到最佳值。您可以添加更多的碳酸氫鈉，直到達到最佳pH值。

注意，標記效率不僅取決于周圍條件，還取決于蛋白質特性。蛋白質表面的三級結構和由此產生的賴氨酸數(shù)量以及等電點和蛋白質在pH 8.3下的行為起作用。

過度標注
過度標記的原因可能是蛋白質表面的大量賴氨酸和/或蛋白質在pH 8.3時的最佳特性。
為了防止過度標記，減少染料量或增加蛋白質濃度。你也可以減少反應時間。

綴合物的純化
染料在水溶液中是不穩(wěn)定的NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加。因此，在每次標記反應中都會產生一定量的游離染料，需要從綴合物中分離出來。
如果純化后的結合物仍然含有微量的游離染料，將其用于第二步純化。通過SDS-PAGE檢查結合物的純度。
在游離染料濃度較高時，從綴合物中分離游離染料變得更加困難。濃度非常高時，色譜柱或膜甚至會被染料堵塞，因此應盡量優(yōu)化標記反應，以降低游離染料的濃度。請記住，總收率受到額外純化步驟的影響。

什么樣的DOL是優(yōu)的？
作為一個基本規(guī)則，每200個氨基酸一種染料是理想的，然而，最佳的標記程度取決于你的蛋白質以及你的預期應用。如果您不確定，請使用不同劑量的少量結合物檢查您的分析，以獲得最佳結果。
在任何情況下都要防止過度標記，因為這可能導致蛋白質聚集或相鄰染料的熒光猝滅。

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