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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)測試盒

簡要描述:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)測試盒 上海牧榮生物科技有限公司專業實驗室產品.為客戶全面解決實驗、生產、開發需求,提供方便、快捷的服務。

  • 產品型號:
  • 廠商性質:代理商
  • 更新時間:2024-05-09
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應用領域醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

PEPCK(EC 4.1.1.32廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中,催化草酰乙酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸,是調節糖異生途徑的關鍵酶。

測定原理:

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。

需自備的儀器和用品:

分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體18 mL×1瓶, 4℃保存;

試劑二:液體16.5uL×1支,4℃保存;

試劑三:粉劑×1支, -20℃保存;

試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;

樣本的前處理:

1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

  1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2、工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三轉移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

3、試劑四的配制:臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

4、將工作液和試劑四置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘。

5、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.1,需將樣本用提取液稀釋適當倍數后測定,使ΔA小于0.1可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

PEPCK活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)PEPCK活力計算

單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3215×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPCK活力計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

單位定義:每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)PEPCK活力計算

單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPCK活力計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

單位定義:每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=12.86×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。


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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)測試盒




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