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肉桂酸4羥化酶(C4H)測試盒

簡要描述:肉桂酸4羥化酶(C4H)測試盒 肉桂酸-4-羥化酶( Cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)試劑盒 上海牧榮生物科技有限公司專業實驗室產品.為客戶全面解決實驗、生產、開發需求,提供方便、快捷的服務。

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  • 廠商性質:代理商
  • 更新時間:2024-05-08
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詳細介紹

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應用領域醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥

肉桂酸4羥化酶(C4H)測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

C4H又稱反式肉桂酸-4-單氧化酶,多存在于高等植物、酵母、菌類中,該酶催化肉桂酸羥化作用產生4-香豆酸鹽,是苯丙烷途徑中繼L-苯丙氨酸解氨酶之后的第二個關鍵酶。

測定原理:

C4H催化肉桂酸和NADP生成4-香豆酸鹽和NADPH,在340nm下測定NADPH生成速率,即可反映C4H活性。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體25 mL×1瓶, 4℃保存;

試劑二:粉劑×2瓶,-20℃保存;

粗酶液提?。?/p>

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟:

  1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

  2. 樣本測定

(1)取試劑二一瓶,加入10mL試劑一充分溶解混勻,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;現配現用(配好后24h內用完);

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二,混勻,立即記錄340nm處初始吸光值A1和 5min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
 

C4H活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

C4H(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘產生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

C4H(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

C4H(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

C4H(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘產生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

C4H(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

C4H(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。


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