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PLA的工作原理

更新時(shí)間:2023-11-21      點(diǎn)擊次數(shù):1383

一、鄰位連接技術(shù)(PLA)的工作原理?

 Duolink®鄰位連接技術(shù)(PLA)是一種高特異性、高靈敏地原位檢測(cè)內(nèi)源性蛋白、蛋白修飾和蛋白互作的強(qiáng)大工具.該技術(shù)可輕松檢測(cè)和定位未改造細(xì)胞和組織內(nèi)單分子級(jí)別的蛋白靶標(biāo)。一般先使用不同種屬來(lái)源的兩種一抗檢測(cè)兩個(gè)蛋白靶標(biāo)(圖1A)。接著用一對(duì)寡核苷酸標(biāo)記的二抗(PLA探針/鄰位探針)結(jié)合一抗(圖1B)。再加入連接寡核苷酸,當(dāng)一對(duì)鄰位探針足夠貼近時(shí),連接寡核苷酸會(huì)與鄰位探針對(duì)互補(bǔ)雜交,在連接酶的作用下形成封閉的環(huán)狀DNA,作為滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的模板(圖1C)。接著DNA聚合酶以PLA探針為引物,以上述環(huán)狀DNA為模板,通過(guò)RCA反應(yīng)合成連環(huán)序列(圖1D)。這使仍與PLA探針相連的序列信號(hào)擴(kuò)大1000倍,方便進(jìn)行信號(hào)定位。最后,用標(biāo)記寡核苷酸與擴(kuò)增子內(nèi)的互補(bǔ)序列雜交(圖1E),在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為散點(diǎn)(PLA信號(hào)),實(shí)現(xiàn)可視化和定量分析(圖1F)。Duolink® PLA技術(shù)可結(jié)合免疫熒光(即綠色、紅色、遠(yuǎn)紅或橙色檢測(cè))或免疫組化(即過(guò)氧化物酶催化反應(yīng))檢測(cè)貼壁細(xì)胞、細(xì)胞離心涂片和組織切片。此外,Duolink® PLA技術(shù)還可結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血液或懸浮細(xì)胞,也可采用多孔板(例如,96384孔板)搭配高內(nèi)涵篩選成像儀進(jìn)行高通量分析。Duolink® PLA 的高特異性、靈敏度和多功能性使其成為信號(hào)通路分析、藥物篩選、IC50 測(cè)定和靶標(biāo)驗(yàn)證的理想選擇。


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二、DUOLINK®鄰位連接技術(shù)檢測(cè)EGFRHER2二聚化?

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRErbB1HER1)和人表皮受體2HER2ErbB2Neu)的二聚化是一種蛋白質(zhì)相互作用(PPI)。EGFRHER2是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員,在細(xì)胞分裂和死亡調(diào)控中起重要作用。影響其中任意一種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的突變與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。當(dāng)配體(如EGF)結(jié)合EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域時(shí),EGFR受體激活并自磷酸化細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)。從而與ErbB家族其他成員形成同源(EGFR-EGFR)和異源(例如,EGFR-HER2)二聚體(圖2)。二聚化及之后的磷酸化發(fā)生后,會(huì)募集一些銜接蛋白,進(jìn)一步激活幾個(gè)胞內(nèi)信號(hào)通路,最終可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗凋亡。

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